技術(shù)分享 | 基于IgG1的雙特異性抗體的設計、表達和純化 |
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2020-06-15 |
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來(lái)源：生物制品圈
摘要：雙特異性抗體（BisAbs）由于具有兩個(gè)不同的抗原結合位點(diǎn)，可以同時(shí)靶向兩種受體從而為癌癥和炎癥等復雜疾病提供可能的治療方法，目前已經(jīng)成為極具研發(fā)前景的新型藥物候選物。本文基于全長(cháng)IgG-scFv形式的BisAbs，提供了下圖所示臨床前研究包含的從分子設計，重組表達到下游純化的方法概述，并討論了優(yōu)化瞬時(shí)表達和純化需要實(shí)際考慮的因素和策略。
?????? 1.?雙特異性抗體概述
?????? BisAbs由兩個(gè)不同抗原結合位點(diǎn)組成一個(gè)抗體分子，與結合單個(gè)靶標的抗體相比，BisAbs具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：
?????? (1)?通過(guò)兩個(gè)靶標結合在不同細胞上，BisAbs可以將特定的免疫細胞（如T細胞和NK細胞）重定向到腫瘤細胞，以增強腫瘤殺傷力；
?????? (2) BisAbs可以同時(shí)阻斷兩種不同介質(zhì)在癌癥和炎癥等復雜疾病的進(jìn)展中的作用；
?????? (3) BisAbs由于與兩個(gè)不同的細胞表面靶標相互作用而增加了結合特異性；
?????? (4) BisAbs促進(jìn)受體聚集，從而促進(jìn)靶標內化和降解。
過(guò)去二十年中，分子工程學(xué)的進(jìn)步導致了一系列具有不同結構和分子量的重組BisAb的開(kāi)發(fā)，目前已經(jīng)有兩種基于IgG的BisAb（catumaxomab和emicizumab-kxwh）和一種片段BisAb（blinatumomab）獲批上市，以及處于不同臨床階段的50多種候選藥物。BisAb可以分為兩類(lèi)，即具有和不具有抗體Fc區的BisAb，前者即IgG樣BisAb由于具有Fc區，因此有助于其純化，溶解性和穩定性，并提供額外功能，例如抗體依賴(lài)的細胞毒性，補體依賴(lài)的細胞毒性，FcRn介導的延長(cháng)半衰期以及藥物結合框架。本文所述BisAbs基于全長(cháng)IgG1抗體支架和單鏈可變區（scFv）。
?????? 1.1?IgG1的結構特征
?????? 如Fig. 2所示，IgG1分子由四個(gè)多肽鏈，即兩個(gè)相同的重鏈（HC）和兩個(gè)相同的輕鏈（LC）組成。HC由一個(gè)可變域（VH）和三個(gè)恒定域（CH1，CH2和CH3）組成。每個(gè)LC包含一個(gè)可變域（VL）和一個(gè)恒定域（CL）。VH和VL?域各自具有三個(gè)互補決定高變區定義抗體的特異性。VH-CH1結構域與VL-CL?結構域相互作用形成抗原結合片段（Fab），每個(gè)IgG1分子都包含兩個(gè)抗原結合位點(diǎn)，其Fc結構域提供效應子功能并延長(cháng)了半衰期。
?????? 1.2?ScFv的結構特征
?????? 在IgG1的模塊化抗體片段中，scFv是產(chǎn)生功能性單價(jià)抗原結合片段的最常用的方式。ScFv由抗體的VH和VL?結構域組成，其中第一個(gè)可變域的C末端通過(guò)柔性肽linker與第二個(gè)結構域的N末端連接（Fig. 3A），包括VL-linker-VH或VH-linker-VL兩種連接方式（Fig.?3B）。由于兩個(gè)可變域的分子間配對混雜，并且VH和VL?結構域之間非共價(jià)相互作用的親和力和特異性相對較低，所以scFv重組生產(chǎn)可能會(huì )導致單體，二聚體和高階多聚體混合物的出現。這些寡聚混合物的形成受linker的長(cháng)度和組成的影響，Fig.?3B所示linker中，(GGGGS)3使最廣泛，但是(GGGGS)4可以最小化上述聚集體的形成。此外，將VH?44和VL?100位點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼嵋孕纬蓛蓚€(gè)域之間的鏈間二硫鍵，也是減少寡聚和提高scFv穩定性的一種廣泛使用的策略（Fig. 3?C，D）。
?????? 2. IgG1-scFv BisAbs的設計
?????? 本文描述的IgG1-scFv BisAbs如Fig. 2中所示，Fig.?4顯示了用于工程化IgG1-scFv的設計示意圖，具體設計策略如下：
?????? 2.1?ScFv設計策略
?????? 所有scFv均選擇VL-VH方向，用(GGGGS)4?linker將VL與VH連接，并將VH?44和VL?100位點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼嵝纬涉滈g二硫鍵，以減少寡聚并提高scFv穩定性（Fig. 3）。
?????? 2.2?IgG1與scFv的連接策略
?????? 提供Fig. 2所示的4種可行性連接策略，具體方案如Fig. 3所示。
?????? 在Bis1Ab中，scFv使用(GGGGS)2?linker連接到LC的N端，原始HC維持不變；在Bis2Ab中，scFv使用(GGGGS)2?linker連接到HC的N端，原始LC維持不變；在Bis3Ab中，scFv?使用(GGGGS)2?linker連接到CH3域的C末端，原始LC維持不變；在Bis4Ab中，scFv使用(GGGGS)2?linker插入到位置220后的鉸鏈域，以連接scFv的N端和C端，原始LC維持不變，輕鏈和重鏈之間以及鉸鏈之間的天然鏈間二硫鍵維持不變。
?????? 上述幾種BisAbs已用于多種治療環(huán)境。例如，基于Bis2Ab的MEDI4276（由MedImmune開(kāi)發(fā)，I期臨床）作為成人晚期乳腺癌或胃癌的二線(xiàn)治療藥物；基于Bis3Ab的MM-141（由Merrimack開(kāi)發(fā)，II期臨床失?。┯糜谥委熮D移性胰腺癌；基于Bis4Ab的MEDI3902（由MedImmune開(kāi)發(fā),?II期臨床）用于預防接受重癥監護的成年患者出現的呼吸機相關(guān)性肺炎。
?????? 3.?IgG1-scFv BisAbs的重組表達
?????? 3.1?表達載體的設計
?????? 這里描述的BisAb與IgG1類(lèi)似,都是由等摩爾比的多肽鏈組成的異二聚體。重組表達是通過(guò)編碼兩個(gè)多肽鏈的單個(gè)載體系統實(shí)現的，每個(gè)多肽鏈都有自己的基因表達盒。使用單載體系統的優(yōu)點(diǎn)包括：
?????? (1)?僅使用一種載體進(jìn)行轉染更加簡(jiǎn)便；
?????? (2)?基于基因表達盒的系統促進(jìn)高通量克??；
?????? (3) LC和HC的基因比例相等，在平衡BisAbs表達的同時(shí)最大程度地減少LC產(chǎn)生過(guò)量。
?????? BisAb重組表達載體示意圖如Fig. 5所示。具體的，兩條BisAb鏈的表達是由單獨的巨細胞病毒啟動(dòng)子（PCMV）驅動(dòng)，BisAb鏈的有效分泌受兩個(gè)單獨的信號肽控制，該信號肽介導兩個(gè)多肽向內質(zhì)網(wǎng)的轉運，以進(jìn)行適當的折疊，組裝和翻譯后修飾。LC多肽信號序列是MDMRVPAQLLGLLLLWLPGPGARC，其是天然人κLC信號肽，HC多肽信號序列是MGWSCIILFLVATATGVHS，其對應于小鼠HC前導序列。載體中包含SV40?多聚核苷酸序列，且存在的獨特限制酶切位點(diǎn)可促進(jìn)抗體可變區的克隆。
?????? 3.2?優(yōu)化DNA密碼子實(shí)現最佳哺乳動(dòng)物表達
?????? 用于BisAb抗體骨架的可變域VH和VL以及scFv的序列可以源自公共數據庫，雜交瘤，噬菌體展示，酵母展示和哺乳動(dòng)物展示。這些DNA序列通常不是最佳的用于在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞最大化重組蛋白質(zhì)表達。
?????? 密碼子會(huì )影響基因表達，穩定性和翻譯效率。DNA序列優(yōu)化包括去除核苷酸重復序列，內部TATA盒，核糖體進(jìn)入位點(diǎn)以及剪接供體和受體位點(diǎn)；減少富含AT或GC序列延伸；優(yōu)化tRNA密碼子的使用頻率，以最大化信使RNA的翻譯和穩定性。除了VH，VL以及scFv之外，BisAb的linker序列和恒定域也可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化。另一個(gè)基因設計策略是通過(guò)密碼子優(yōu)化過(guò)程來(lái)減少LC的表達（因為L(cháng)C通常比HC過(guò)表達）。
?????? 3.3?DNA載體制備
?????? 使用無(wú)內毒素質(zhì)粒DNA純化方法制備BisAb表達載體（例如來(lái)自Qiagen的EndoFree質(zhì)粒試劑盒（#12362））。內毒素是從細菌中提取的質(zhì)粒DNA中的常見(jiàn)污染物。因此，在生產(chǎn)用于體外和體內研究的BisAb時(shí)，必須使用無(wú)內毒素的材料和試劑?？梢园凑帐謨允褂肅harles River Endosafe PTS系統（#PTS100）確定內毒素的存在，小于0.1 EU/mg的質(zhì)粒DNA被認為不含內毒素。DNA載體制備好后可儲存于-80℃備用。
?????? 3.4?制備用于瞬時(shí)表達的哺乳動(dòng)物細胞
?????? 制備DNA載體后，通過(guò)CHO懸浮細胞進(jìn)行瞬時(shí)表達。使用添加有25μM蛋氨酸亞砜亞胺（MSX）和100μg/ mL潮霉素-B（HB）的MedImmune專(zhuān)用培養基培養和維持細胞。在2升一次性聚碳酸酯錐形培養瓶（VWR,?#FPC2000S）使細胞以500 mL的體積生長(cháng)，將瓶置于37℃，140rpm，?5%CO2環(huán)境下的Multitron培養箱（InforsHT）中培養。每3天分裂一次細胞，以確保存活率保持在97%以上，并且細胞密度不超過(guò)5×106?/ mL。
?????? 3.5?瞬時(shí)轉染表達
?????? 在轉染過(guò)程中加入HB和MSX將對細胞活力有害，因此我們將細胞以0.5×106?/mL的濃度在不含HB和MSX的MedImmune培養基中傳代培養?3天，以稀釋CHO懸浮培養時(shí)引入的HB和MSX。
?????? 轉染前：轉染前24h，用MedImmune培養基將細胞稀釋至1×106?/mL，以在轉染時(shí)獲得濃度約為2×106?/mL的細胞。
?????? 轉染中：對于500 mL轉染，我們向7.5 mL 150 mM無(wú)菌氯化鈉溶液中添加了500μg無(wú)內毒素的DNA。在另一個(gè)無(wú)菌試管中，我們向5 mL 150 mM無(wú)菌氯化鈉中加入2.5 mL?1 mg/mL聚乙烯亞胺（PEI,?#24756-1）。然后將DNA和PEI溶液合并，并在室溫下孵育1?min，隨后將DNA/PEI混合物添加到細胞中，并持續至少4 h的培養過(guò)程。此后，向轉染細胞中加入3.3%（v/v）的MedImmune原料A和0.2%（v/v）的MedImmune原料B，并轉移至34°C的培養箱進(jìn)行瞬時(shí)表達。
?????? 轉染后：在轉染后3，7，10和14天確定細胞活力和表達水平，瞬時(shí)表達在轉染后14天或當細胞活力降至70%以下時(shí)終止。
?????? 3.6?細胞活力的測定
?????? 使用Visell XR細胞活力分析儀（Beckman Coulter）測定細胞活力和密度。該系統設置為使用一次抽吸循環(huán)混合3次，并收集30張最小直徑為5μm，最大直徑為10μm的圖像。亮度設置為85%，清晰度設置為100，活細胞斑點(diǎn)亮度設置為65%，活細胞斑點(diǎn)面積設置為5%，減聚度為中等。這些設置對于我們在瞬時(shí)表達方案中使用的CHO細胞是最佳的。
?????? 3.7?瞬時(shí)表達后的CHO收獲
?????? 轉染后十四天或當細胞活力降至70%以下時(shí)，使用Beckman Coulter Allegra X 15R臺式離心機在室溫下離心（1000?g）?20?min收集CHO細胞。丟棄細胞并通過(guò)0.22 μm真空過(guò)濾裝置（VWR，#97066-204）過(guò)濾培養基。過(guò)濾后的培養基可以在4°C或-80°C下存儲，解凍后建議重新過(guò)濾存儲的培養基。
?????? 3.8?BisAb的定量
?????? 使用下述方法來(lái)量化細胞培養期間以及收獲和過(guò)濾后得到的BisAb。該定量方法基于將BisAb結合至與Agilent 1200高效液相色譜（HLPC）連接的蛋白A柱（POROS A，20μM，4.6×100 mm，1.7 mL，Thermo Fisher Scientific#2502226?）上。
?????? BisAb檢測：通過(guò)0.2μm離心過(guò)濾器（VWR，#82031-356）過(guò)濾培養基（150 μL）。然后將過(guò)濾的培養基（100 μL）注入HPLC蛋白A系統，并執行以下步驟：100%流動(dòng)相?A（0.5min），100%流動(dòng)相??B（1.5?min），100%流動(dòng)相A（2?min）。在室溫下以3.5mL/min進(jìn)行色譜操作，并于280 nm吸光度下檢測BisAb。其中，結合流動(dòng)相A為1×PBS，pH 7.2（Thermo Fisher Scientific，#20012-027），洗脫流動(dòng)相B為含有0.1％磷酸（v/v）的1x PBS pH 1.8。
?????? 標準曲線(xiàn)制作：按照上述相同的方法制作標準曲線(xiàn)（Fig. 6A）。使用15.6至2000μg（15.6，31.25，62.5，125，500，1000和2000μg）范圍的99%單體IgG1制作標準曲線(xiàn)，并繪制樣品濃度與每種洗脫標準品在280 nm處洗脫曲線(xiàn)（Fig.6?B）下面積的關(guān)系，然后通過(guò)將曲線(xiàn)下的面積乘以標準曲線(xiàn)的斜率的倒數來(lái)計算BisAb的濃度。Fig.7為轉染10天后4種特異性BisAb的瞬時(shí)表達數據（于第14天終止）。
?????? 4.?IgG1-scFv BisAbs的純化和評估
?????? 4.1?從培養基中純化BisAb
?????? BisAb的純化使用蛋白A?親和色譜法進(jìn)行，該方法通常用于純化具有完整Fc區的IgG1和BisAb。此處提供的方法使用500 mL培養基和1個(gè)5 mL MabSelect?Agarose Fast Flow（GE Health Life Sciences, #28-4082-55，載量為30 mg/mL），可以根據起始培養液的體積和預期規模進(jìn)行適當縮小或放大。
?????? 準備工作與介質(zhì)平衡：將色譜柱連接到AKTA Pure系統（GE Health Life Sciences），在室溫下于5mL/min流速，280nm波長(cháng)監控下進(jìn)行純化。首先用10倍柱體積（CV）的無(wú)菌水處理該柱，以去除20%乙醇存儲溶液，然后用10 CV無(wú)內毒素的1x PBS，pH 7.4（結合緩沖液）平衡介質(zhì)。
?????? BisAb吸附：將過(guò)濾后的澄清上清液加載到色譜柱，然后用結合緩沖液沖洗10 CV以洗去未結合的雜質(zhì)污染物，各組分收集后保存在4°C以便進(jìn)行后續分析（如果需要）。
?????? BisAb洗脫：使用0.1 M甘氨酸-HCl，pH 2.2?洗脫親和捕獲的BisAb。在預裝有50μL 1.0 M Tris-HCl，pH 7.0且不含內毒素的1.5 mL?Eppendorf管中收集500μL洗脫組分。洗脫組分可在4°C下最多保存3天，然而這種儲存有可能導致抗體聚集。
?????? 抗體聚集是低pH條件下從蛋白A色譜中洗脫BisAb經(jīng)常遇到的挑戰。為了使聚集最小化并提高產(chǎn)量，我們經(jīng)常采用洗脫優(yōu)化方法，例如使用3.2的pH值，并向洗脫緩沖液中添加0.1 M的精氨酸，這已被證明可以防止抗體聚集。洗脫后進(jìn)行色譜柱再生，即將蛋白A柱用5 CV的0.1 M甘氨酸-HCl（pH 2.2），10 CV的結合緩沖液，10 CV的超純水和10 CV的20%（v/v）乙醇洗滌。
? ? ?? 4.2?BisAb濃度測定
?????? 使用Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000分光光度計在280 nm處測定吸光度，再根據理論消光系數確定上述洗脫組分中的BisAb濃度。
??? ?? 4.3?BisAb單體含量測定
?????? 通過(guò)尺寸排阻高效色譜分析（SEC-HPLC）測定上述洗脫組分中的BisAb單體含量。使用配備自動(dòng)進(jìn)樣器，高壓梯度溶劑輸送泵，色譜柱室和二極管陣列檢測器（在280 nm波長(cháng)檢測）的Agilent 1260系列HPLC系統，以及Tosoh Bioscience的TSKgel G3000SWxl SEC色譜柱（300×7.8 mm，250?，粒徑5 μm）。
?????? 室溫下的運行條件包括流速1 mL/min；運行時(shí)間20min；流動(dòng)相100 mM磷酸鈉和100 mM硫酸鈉，pH 6.8。每次分析使用100μg?BisAb。蛋白質(zhì)A純化和陶瓷羥基磷灰石層析（CHT）純化（用于去除聚集體）后BisAb的典型SEC-HPLC色譜圖如Fig.?8?A, C所示。由于疏水性增加，某些BisAb可能在SEC凝膠基質(zhì)上發(fā)生非特異性吸附，從而導致保留時(shí)間偏移和較差的峰分辨率。我們發(fā)現向流動(dòng)相中添加10%異丙醇（v/v）（Sigma Aldrich，#I95516）可以減少非特異性吸附，從而提高色譜分辨率。
?????? 4.4?去除聚集體和其他雜質(zhì)
?????? CHT被廣泛用于從聚集體和其他蛋白A純化后的雜質(zhì)中純化單體抗體和BisAb??？贵w或BisAb與CHT樹(shù)脂之間存在多種相互作用方式，主要方式是抗體或BisAb表面胺與CHT樹(shù)脂磷酸基團之間的陽(yáng)離子交換，以及CHT樹(shù)脂鈣位點(diǎn)于抗體或BisAb羧基之間的金屬螯合。
?????? 準備工作：我們使用預裝的II型CHT樹(shù)脂（BioRad，E732-4334；載量為15–25 mg/mL）和磷酸鹽緩沖液的線(xiàn)性梯度溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。使用AKTA Pure系統（GE Health Sciences）在室溫下以5 mL/min和280 nm的吸光度進(jìn)行純化。流動(dòng)相A為pH 7.0的10 mM磷酸鈉，流動(dòng)相B為pH 7.0的含2 M NaCl的10 mM磷酸鈉。
?????? 純化過(guò)程：將上述蛋白A色譜洗脫下的BisAb上樣到預先平衡過(guò)的CHT柱上，然后用5 CV流動(dòng)相A洗去雜質(zhì)。然后通過(guò)在25 CV內線(xiàn)性梯度切換至100%流動(dòng)相B對BisAb進(jìn)行洗脫。BisAb的典型CHT色譜圖如Fig.8B所示，包括聚集體在內的雜質(zhì)在單體之前被洗脫。收集每個(gè)主峰的1 mL餾分，然后使用SEC-HPLC分析其單體含量?？梢钥吹?，使用CHT純化后BisAb單體含量為97%（Fig.?8C），在CHT之前該數值為70%（Fig.8?A）。隨后按照手冊對CHT色譜柱進(jìn)行再生，并保存在0.1 N NaOH中。
?????? 4.5?制劑
?????? CHT后，將合并的單體BisAb餾分使用0.22-μm注射器過(guò)濾器（VWR，#28144-040）進(jìn)行過(guò)濾，并在25 mM組氨酸-HCl，7%蔗糖，pH 6.0中于4°C下透析過(guò)夜。透析后將BisAbs用0.22-μm注射器式過(guò)濾器重新過(guò)濾，然后使用Mustang E注射器式過(guò)濾器（VWR，#28140-521）過(guò)濾，以去除潛在的內毒素污染。加入聚山梨酯-80至終濃度為0.02%（v/v）。確認單體含量，并且制備等分的BisAb，如果其單體含量>97%，則將其保存在-80°C中。
?????? 5.?結論
?????? BisAb在癌癥免疫治療中具有廣泛的應用潛力，它們可以以更加特異性的方式重定向效應細胞，改善組織選擇性并將細胞毒性有效載荷遞送至靶點(diǎn)。本文全面描述了BisAbs的設計，表達以及純化的方法。
?????? 由于本文的BisAbs中存在Fc區，因此此處的設計，表達和純化方法可以推廣應用到IgG樣BisAb的工藝開(kāi)發(fā)中。但是，BisAb開(kāi)發(fā)中的一些挑戰仍然需要改進(jìn)，例如優(yōu)化純化過(guò)程和回收率以確保穩健，穩定和可放大的BisAb生產(chǎn)工藝過(guò)程等。本文提供的方法用于在臨床前研究中使用CHO細胞制備大量BisAb（7周內即可完成）。所需試劑和材料大部分在市場(chǎng)可以買(mǎi)到，但表達載體，細胞培養基和細胞培養原料來(lái)自MedImmune，因此當使用可商購的抗體表達載體和培養基時(shí)，可以對策略和方法進(jìn)行適當調整和優(yōu)化。
?????? 如涉及知識產(chǎn)權請與我司聯(lián)系
參考來(lái)源：
Dimasi N, Fleming R, Wu H, et al. Molecular engineering strategies and methods for the expression and purification of IgG1-based bispecific bivalent antibodies[J]. Methods, 2019: 77-86.
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