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“?腫瘤微環(huán)境中靶點(diǎn)蛋白表達水平，浸潤的T細胞，及其他類(lèi)型的免疫細胞與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）的應答密切相關(guān)。利用測序等生物信息學(xué)方法建立模型預測ICI的響應”?
01
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PD-L1表達?
預計PD-L1的表達對Anti-PD-L1或anti-PD1的治療有一定的作用。因此，免疫組織化學(xué)(IHC)檢測PD-L1蛋白的表達已被應用于臨床。目前，FDA已批準PD-L1IHC作為NSCLC患者anti-PD1治療的配套診斷。例如，pbrobrolizumab被批準用于PD-L1非小細胞肺癌患者(定義為PD-L1，至少50%的腫瘤細胞用于一線(xiàn)使用，至少1%用于二線(xiàn)使用)。盡管如此，PD-L1的表達仍然是免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）反應一個(gè)不完全的預測因子。對多種腫瘤類(lèi)型的多項研究發(fā)現PD-L1的表達與ICI反應或OS呈正相關(guān)，而其他研究則未發(fā)現相關(guān)性（如頭頸部腫瘤等）。
PD-L1生物標志物研究結果矛盾的潛在原因包括使用不同的檢測方法、PD-L1表達的時(shí)態(tài)和ITH以及評估陽(yáng)性程度的非標準化標準，例如PD-L1相對染色強度，和百分比等。此外，即使PD-L1的表達與反應相關(guān)，也有許多低到無(wú)PD-L1表達的患者經(jīng)歷了持久的臨床受益。因此，PD-L1狀態(tài)可能不是臨床治療決策的一個(gè)足夠全面的獨立生物標記物。重要的是，一項對聯(lián)合使用anti-CTLA 4和anti-PD1的非小細胞肺癌患者的研究發(fā)現，PD-L1染色和TMB是獨立的反應預測指標，包含這兩種因素的多變量模型提高了預測的敏感性和特異性。最近，在keynote189三期臨床試驗中，有報道說(shuō)PD-L1水平可能是在NSCLC患者一線(xiàn)治療中對pembrolizumab單抗加化療的反應的預測。研究人員觀(guān)察到，PD-L1在各級表達水平上，對免疫治療加化療方案的應答者的PD-L1表達增強，但隨著(zhù)PD-L1閾值的放寬，PD-L1陽(yáng)性表達的預測作用明顯減弱。作為另一個(gè)重要的警告，一些研究發(fā)現PD-L1表達的細胞類(lèi)型也應該考慮到。在黑色素瘤和尿路上皮癌患者的獨立隊列中，發(fā)現PD1在腫瘤浸潤的免疫細胞上的表達，而在腫瘤細胞本身上不表達，分別與抗PD1和抗PDL1的反應有關(guān)。?
02?
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腫瘤浸潤淋巴細胞：密度、表型和多樣性?
人們認為，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）治療，特別是anti-PD1和anti-PD-L1，部分是通過(guò)激活已有的腫瘤免疫應答起作用的。因此，ICI反應的另一個(gè)潛在預測因素是腫瘤內腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的密度。事實(shí)上，TIL密度是一些腫瘤類(lèi)型的強陽(yáng)性預后指標，而不考慮ICI治療。例如，一種被稱(chēng)為免疫核心的指標，涉及對腫瘤中心和周?chē)腃D8 T細胞進(jìn)行量化，是OS的一個(gè)強有力的預測因子，可以補充CRC中傳統的腫瘤淋巴結轉移(TNM)分期或MSI狀態(tài)。值得注意的是，單細胞測序顯示CD4記憶T細胞也在對ICI 有反應的人類(lèi)黑色素瘤中富集。在抗PD1治療的背景下，據報道，IHC在腫瘤侵襲性邊緣測量的TIL密度與抗-PD1反應密切相關(guān)，這種方法可能很有前途，但很難標準化，需要更多的數據來(lái)說(shuō)明該方法的通用性。
越來(lái)越多的證據表明，影響ICI結果的不僅僅是TIL的位置和密度，還有TIL的表型。例如，雖然抗PD1治療后，抗CTLA 4的患者TIL濃度沒(méi)有明顯變化，但應答與T效應細胞活性指標CYT 50(以穿孔素1(PRF 1)和顆粒酶轉錄水平54的幾何平均數計算)的增加有關(guān)。值得注意的是，不論腫瘤類(lèi)型如何，CYT與tmb都有顯著(zhù)的相關(guān)性，這支持了這樣的觀(guān)點(diǎn)，即癌癥的免疫控制涉及T細胞介導的對來(lái)自nssnv的腫瘤新抗原的溶細胞反應。
除了T效應細胞活化表型外，其他T細胞表型標記也與ICI反應相關(guān)。例如，TIL表面表達的PD1水平可能與抗腫瘤免疫反應的效果有關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，對非小細胞肺癌患者TIL的分析顯示，在PD1表達的基礎上，有三種不同的CD8 T細胞。PD1表達最高的腫瘤群體稱(chēng)為PD1Tumour(PD1T)，因為PD1T與慢性病毒感染相關(guān)的PD1hi細胞在轉錄上明顯不同。在三個(gè)分離的CD8 T細胞群中，只有PD1T細胞能夠在體外對自體腫瘤細胞產(chǎn)生細胞因子反應，這表明該細胞群在腫瘤抗原特異性T細胞中富集。重要的是，治療前PD1T細胞水平與抗PD1應答呈正相關(guān)；然而，這些結果仍有待于驗證隊列的驗證。相反，在小鼠體內的研究表明，由于Treg細胞相互作用、染色質(zhì)重塑或轉錄重組，在慢性抗原暴露下，PD1高表達的T細胞可能表現出不可逆轉的耗竭表型。此外，一項對HNSCC患者的研究發(fā)現，高PD1表達的腫瘤內T細胞百分比與切除后PFS 差直接相關(guān)，但這些患者未接受ICI治療，而HPV狀態(tài)可能是HNSCC的一個(gè)混雜變量。另一項針對抗PD1治療的非小細胞肺癌患者的研究發(fā)現，腫瘤和外周血中積累的CD4 FOXP 3?PD1hi T細胞(4PD1hi)是腫瘤負荷的一種功能。重要的是，治療時(shí)外周血4PD1hi細胞計數的下降與這個(gè)隊列中OS的改善顯著(zhù)相關(guān)。NSCLC相關(guān)的PD1T細胞的一個(gè)獨特的特征是它們表達趨化因子CXCL13，它專(zhuān)門(mén)招募B和T濾泡輔助(TFH)細胞。CXCL 13-TFH細胞-B細胞軸曾被證明與非ICI治療的CRC患者的長(cháng)期存活有關(guān)。雖然人們普遍認為B細胞和TFH細胞不是抗腫瘤免疫應答的主要成分，但這些發(fā)現表明腫瘤微環(huán)境的這一部分可能需要在ICI反應的背景下進(jìn)一步研究。
應用新的單細胞RNA測序(scRNA-seq)平臺允許高分辨率的表型特征，這是不可能的批量測序方法。對32例經(jīng)ICIS治療的轉移性黑色素瘤患者的單細胞轉錄組數據進(jìn)行了非監督聚類(lèi)，確定了兩種主要的腫瘤內CD8 T細胞表型：記憶型和疲勞型。記憶樣TILs與疲勞TIL的比值與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIS）的反應密切相關(guān).此外，還發(fā)現轉錄因子Tcf 7在具有記憶樣表型的T細胞中被選擇性表達。因此，CD8 tcf 7和CD8 tcf 7?TIL的比值與抗-pd 1治療的黑色素瘤患者的應答和生存密切相關(guān)，即使在總T細胞浸潤沒(méi)有明顯差異的情況下也是如此。
一種有效的T細胞反應涉及特異性抗原反應T細胞克隆的激活和擴增.因此，腫瘤內或外周T細胞庫的克隆結構可能是與ICI反應相關(guān)的腫瘤免疫原性的另一個(gè)指標。T細胞庫多樣性可以用兩種互補指標來(lái)量化：豐富度，即獨特的TCR序列數和克隆性，即序列分布的均勻性(低克隆性表示所有克隆的分布相等，高克隆性表示傾斜或寡克隆群體，少數克隆占主導地位)。腫瘤內或外周T細胞的多樣性與ICI反應之間的關(guān)系似乎是復雜的，因為一些研究發(fā)現治療前或治療后的克隆性水平與反應呈正相關(guān)，而另一些研究表明，只有在治療中增加克隆性與抗-PD1應答相關(guān)。另一項針對30例黑色素瘤患者的研究發(fā)現，TIL多樣性與抗-PD1反應或存活無(wú)關(guān)，但沒(méi)有檢測治療后的變化。有趣的是，一項對29例經(jīng)抗PDL 1治療的尿路上皮癌患者的研究發(fā)現，治療前外周T細胞克隆性與PFS和OS呈負相關(guān)，而T細胞內克隆性與生存期無(wú)相關(guān)性。同樣，一項對25例轉移性胰腺癌患者的研究發(fā)現，抗CTLA 4治療的患者外周血T細胞克隆性與生存呈負相關(guān)，但與抗PD1無(wú)關(guān)。更復雜的是，先前的免疫治療暴露可能會(huì )影響T細胞儲備動(dòng)力學(xué)在隨后的抗-PD1的使用。具體來(lái)說(shuō)，在治療中，抗CTLA4治療的黑色素瘤患者體內T細胞豐富度的增加與抗PD1反應有關(guān)，而T細胞克隆性的增加與免疫治療中的抗PD1反應有關(guān)。這些結果表明，需要做更多的工作來(lái)闡明腫瘤內和外周T細胞多樣性作為ICI反應指標的效用。?
03
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腫瘤微環(huán)境不只有T細胞?
許多其他類(lèi)型的免疫細胞可能影響ICI的療效。雖然目前還沒(méi)有通過(guò)FDA批準的檢測方法來(lái)預測免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）的療效，但目前正在做的工作是破譯這些細胞類(lèi)型對應答率的影響。為了更全面地了解腫瘤的免疫微環(huán)境，從RNA測序結果中提取免疫細胞表型和豐度數據的方法已經(jīng)發(fā)展成。這種計算被應用于治療前和治療后黑色素瘤患者的腫瘤樣本，發(fā)現抗-PD1反應與CD8 T細胞和自然殺傷細胞的增加和巨噬細胞的減少有關(guān)。這一補充數據提示髓系細胞在ICI反應中具有潛在的抑制作用。在一組獨立的黑色素瘤患者中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMS)與不良的抗PD1反應之間存在類(lèi)似的相關(guān)性。
此外，在黑色素瘤患者中，骨髓源性抑制細胞(MDSCs)的低分化群體的外周血水平與抗CTLA 4反應不佳有關(guān)。事實(shí)上，在一項利用機器學(xué)習來(lái)識別所有TCGA腫瘤樣本CYT預測參數的研究中，最關(guān)鍵的特征之一是缺乏MDSC 。該模型的另一個(gè)主要特征是CD8 T細胞、γδT細胞和自然殺傷細胞的富集，以及Treg細胞的耗竭。值得注意的是，免疫表型核心在兩組獨立的ICI患者中區分應答者和非應答者的敏感性和特異性都很高。在一項對腎癌患者的獨立研究中，在接受抗-PDL 1的患者中，高的瘤內髓樣信號與PFS中位數下降近有關(guān)，再次強調髓系細胞對ICI反應的抑制作用。值得注意的是，聯(lián)合使用VEGF抑制劑可使髓細胞含量高的腫瘤患者的中位pfs增加8倍以上，這表明髓系信號可能是選擇RCC患者聯(lián)合治療的有用的生物標記物。
髓系細胞的特異性亞群可能在調節T細胞排斥中起重要作用。據報道，LY6ClowF4/80巨噬細胞可調節T細胞對胰腺癌的排斥作用。這些巨噬細胞位于腫瘤微環(huán)境之外，它們協(xié)調了獲得性T細胞免疫特權的位點(diǎn)，并消除了它們，提高了免疫治療誘導T細胞依賴(lài)性腫瘤殺傷的能力?？傊?，對腫瘤微環(huán)境的檢查顯示出作為ICI療效的預測生物標記物的巨大前景。?
04
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轉錄和表觀(guān)遺傳標記?
RNA測序數據的生物信息學(xué)分析已被用于揭示與ICI反應或耐藥性相關(guān)的全球腫瘤和微環(huán)境特征。一項研究確定了治療前的特征，包括28個(gè)黑色素瘤患者組中與抗PD1抵抗相關(guān)的26個(gè)轉錄亞信號。然而，在另外兩個(gè)獨立的黑色素瘤組中，這一特征與抗CTLA 4或抗PD1反應無(wú)關(guān)，這表明它可能反映了分析過(guò)的原始隊列特有的特征。另一項對抗PD1治療的黑色素瘤患者的研究發(fā)現，治療前RNA表達特征與腫瘤克隆結構的治療改變有關(guān)。據推測，由于腫瘤克隆結構的改變與反應和OS有關(guān)，治療前的RNA信號也可能是治療結果的預測。事實(shí)上，這一RNA特征與改善兩個(gè)獨立黑色素瘤組的存活率有關(guān)，其中一個(gè)只使用抗PD1，另一個(gè)用抗CTLA 4或抗PD1治療。
初步數據表明，這種炎癥基因特征在預測腫瘤類(lèi)型中具有預測價(jià)值。最近的工作已經(jīng)利用單細胞轉錄組分析精細的細胞分辨率來(lái)確定與T細胞排斥相關(guān)的腫瘤細胞轉錄程序。這一特征是預測不良的ICI反應和降低生存率在多個(gè)獨立的黑色素瘤患者隊列。值得注意的是，體外實(shí)驗表明CDK 4和CDK 6抑制可以逆轉這種T細胞排斥方案，從而為表達這一轉錄程序的腫瘤患者提供了一種潛在的聯(lián)合策略。
除了基因組和轉錄特征外，表觀(guān)遺傳改變也可能與對ICIS的反應有關(guān)。利用DNA甲基化微陣列，與ICI反應相關(guān)的表觀(guān)遺傳標記在NSCLC患者的獨立隊列中被識別和驗證。此外，單個(gè)基因FOXP3的甲基化狀態(tài)也可以預測ICI的應答。
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