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雙特異性抗體與T細胞重定向
使用雙特異性抗體分子進(jìn)行T細胞重定向，是非常有前景的腫瘤治療策略。
雙特異性抗體，約50%為CD3靶向的雙特異性抗體（BsAb），包括catumaxomab (Removab?, Epcam x CD3, Trion Research GmbH,approved in the European Union in 2009),銜接T細胞的雙特異性抗體（BiTE）blinatumomab (Blincyto?, CD19xCD3,Micromet/Amgen, approved by the US Food and Drug Adiministration in 2015）。50kDaBiTE被設計成在一個(gè)多肽鏈中有兩個(gè)單鏈可變片段(ScFv)結構域。此外，正在研究從納米抗體(25 KDa)到IgG-融合(≥150 kDa)的多種形式。
雖然較小的分子具有連接細胞間距離較短的優(yōu)點(diǎn)，并且可以顯示更好的腫瘤穿透性，但需要進(jìn)行Fc改造，通過(guò)FcRn介導的循環(huán)和調節Fc活性來(lái)控制血清的半衰期。?
T細胞殺傷活性需要形成免疫突觸（ISs），是將T細胞鏈接到呈遞有多肽-MHC復合物的目標細胞。激活的的免疫突觸，導致釋放的細胞毒性顆粒和細胞因子.由于空間鄰近T細胞和靶細胞在ISs形成過(guò)程中，大分子如CD45被排除在膜間之外空間。這允許細胞間距離為15 nm，與IgG 1的Fab臂的距離大致相同。
使用BsAb的T細胞重定向需要模仿IS，這是通過(guò)與靶細胞表面抗原結合的CD3與靶細胞結合來(lái)橋接T細胞受體復合物來(lái)實(shí)現的。多種因素可以影響T細胞重定向活動(dòng)，如靶向臂的差異親和力，如CLL1xCD3 knob-in-hole IgG1BsAb的例子所示。MCSPxCD3 BiTE和FcRH5xCD3BsAb的表位結合距離也很重要。
在針對5T4膜近端結構域的T細胞上，在嵌合免疫受體(CIR)的胞外部分插入Fc-based linker也能增強T細胞的活化和靶細胞殺傷。相反，在沒(méi)有Fc-based linker情況下，表達CIR時(shí)，針對CD19的T細胞被激活到更高的水平，但沒(méi)有更有效地殺傷靶細胞。因此，結構特征，如與膜的抗原表位的可及性和距離以及bsAb的靈活性，對有效的T細胞重定向有重要影響。
IgG亞型結構差別
BsAb的IgG亞型也會(huì )由于可變區域展示、鉸鏈序列和二硫鍵結構的變化而影響其功能活性。IgG的鉸鏈區連接Fc結構域和Fab結構域，每個(gè)IgG亞類(lèi)的長(cháng)度、序列和二硫鍵結構各不相同。
IgG1具有較長(cháng)的鉸鏈區，有兩個(gè)二硫鍵。IgG2的鉸鏈區最短，也是最堅硬的，因為它存在于三個(gè)主要異構體中的四個(gè)二硫鍵。IgG4的鉸鏈與IgG2的鉸鏈區氨基酸長(cháng)度相同（12個(gè)氨基酸），但含有更多的脯氨酸，而不是半胱氨酸殘基，并且只有一個(gè)類(lèi)似IgG1的二硫鍵結構。這些結構變化影響著(zhù)IgG鉸鏈區的柔韌性，IgG1>IgG4>IgG2。IgG1是柔韌性最好的（由電子顯微鏡觀(guān)測）。用小角度X射線(xiàn)散射(SAXS)分析不同IgG亞bAb結構域的構象。IgG1分子是封閉Y、中間Y/T和廣泛開(kāi)放T構象的等量混合物。IgG4分子以Y/T構象為主，而IgG 2分子以Y構象為主。盡管IgG1、IgG2和IgG4亞型被用作治療生物制劑的框架,IgG亞型對T細胞重定向的影響未詳細研究。
IgG亞型對T細胞重定向研究
分子設計
Janssen BioTherapeutics的科學(xué)家，通過(guò)controlled Fab-arm exchange (cFAE)技術(shù)，建立IgG1，IgG2，IgG4三種亞型的CD3XCD19雙特異性抗體。結合CD19膜遠端結構域的親本抗體是以人源化的blinatumomab（博納吐單抗）為基礎的，結合CD3e鏈的親本抗體是基于OKT3的可變區。為了盡可能減少Fcγ受體（FcγR）的影響，采用Fc突變，減少其與FcγR的結合：IgG1 FES, IgG2 σ1and IgG4 PAA。
設計兩個(gè)IgG亞型，將IgG1和IgG4的F（ab）2包含鉸鏈區融合到IgG2 σ1-Fc (命名為 IgG1:2 σ1 and IgG4:2 σ1）。
所有亞型的蛋白質(zhì)和細胞結合通過(guò)SPR和流式細胞術(shù)來(lái)進(jìn)行。BsAb能將T細胞連接到其各自的靶細胞，并抑制靶細胞的增殖，以此評價(jià)其體外活性。
試驗數據
1.?各亞型雙特性抗體分子質(zhì)量控制
RSV：specificity control
2.?各亞型BsAb和Fc受體的結合能力
FcRn結合不受影響，因而對藥物血液半衰期沒(méi)有影響。所有由IgG2σ1 Fc組成的分子與FcγRs相互作用最少。在抗體依賴(lài)細胞介導的細胞毒性、補體介導的細胞毒性和抗體依賴(lài)的細胞吞噬作用等多種體外功能試驗中，IgG 2σ1與FcγRs的相互作用有限，在體外轉化為低活性或無(wú)活性。
3.?各亞型BsAb和抗原、CD19B細胞淋巴瘤、T細胞結合力
HBL-1：CD19-expressing B-cell lymphoma lines (low CD19 receptor density(RD)
Daudi：(high CD19 RD)
所有分子單臂親和力<3X范圍內，表明IgG亞類(lèi)和分子形式(抗體與BsAb)對體外親和力均無(wú)顯著(zhù)影響。同樣，CD19各IgG亞類(lèi)細胞結合是平等的，與CD19RD和RFP-轉導無(wú)關(guān).由于二價(jià)IgGs比與BsAb的結合弱2-3倍，這些觀(guān)察表明分子的親和力很小。相反，CD3特異性BsAb結合T細胞的能力比他們的雙價(jià)親本抗體弱10倍，提示CD3的親和力比CD19更強。這可能是由抗原本身驅動(dòng)的，特別是特定的抗原表位，它們允許CD3的二價(jià)結合，而不是CD19的二價(jià)結合。
4. 各抗體亞型細胞聚合能力
5. 各IgG亞型抑制B細胞淋巴瘤增殖能力?
概括
雙特異性抗體(BsAbs)介導的T細胞重定向是一種很有前途的腫瘤治療方法。雙重抗原結合對T細胞的重定向是必需的，并受依賴(lài)于其IgG亞類(lèi)的BsAb的結構特性的影響。在本研究中，針對CD19xCD3的BsAb是在攜帶Fc突變的IgG1、IgG2和IgG4的變異體中產(chǎn)生的，它們減少了FcγR的相互作用（避免CDC，ADCC等副作用），兩種嵌合IgG亞型為IgG 1：2和IgG 4：2，其中IgG 1-或IgG 4-F(Ab)2被嫁接在IgG 2 Fc上。含有IgG 2或IgG 4-F(Ab)2結構域的分子是結構最緊密的分子。所有的BsAb都被證明與它們的目標蛋白(和相應的細胞)結合得同樣好。然而，CD19xCD3?IgG 2不能同時(shí)結合這兩種抗原，這是由于T細胞沒(méi)有與靶細胞聚集。這意味著(zhù)IgG2 BsAb在T細胞重定向試驗中的作用減弱.IgG 4：2和IgG 1：2嵌合亞型IgG2BsAb的活性完全恢復。這證實(shí)了F(Ab)2區對BsAb功能活性的重要貢獻，表明不同Fc和F(Ab)2結構域的工程改造分子可以調控BsAb的功能。?
核心內容總結
IgG2型因為鉸鏈區短且柔韌性差，如果整體雙特異性抗體亞型為IgG2，則T細胞的重定向效果最差。但IgG2型Fc和FcγRs結合最弱，可以引起最小的毒副作用。
將IgG1和IgG4含鉸鏈區的F（ab）2和IgG2的Fc段連接成嵌合分子，則可以將T細胞重定向和最小毒副作用兩個(gè)優(yōu)勢結合在一起。并且減少使用突變技術(shù)改造Fc段，因為有研究報道突變，可以改變抗體藥物的免疫毒性，引起臨床毒性反應。采用IgG2天然的Fc段可以一定程度解決這個(gè)問(wèn)題。?
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