? ? ?? 來(lái)源：生物制品圈
? ? ?? 抗體藥物包括單克隆抗體藥物，抗腫瘤單抗偶聯(lián)物，雙特異性抗體，抗體片段等等。這些藥物的靶點(diǎn)主要是細胞表面與疾病相關(guān)的抗原或特定的受體分子?？贵w進(jìn)入人體之后，首先與相應抗原發(fā)生特異性結合，再通過(guò)一系列的生物學(xué)作用，如偶聯(lián)放射性核素的殺傷作用、阻斷細胞因子的信號轉導、引起補體的級聯(lián)激活等，進(jìn)而發(fā)揮抗體的治療作用。
? ? ?? 在抗體藥物的臨床前研發(fā)中，一旦確定抗體藥物的分子形式并在哺乳動(dòng)物細胞中表達出抗體蛋白分子后，就需要對抗體的活性進(jìn)行驗證與測定?；钚詼y定是對藥物的有效成分和含量以及藥物效價(jià)的測定，是確?？贵w類(lèi)藥物有效性的重要質(zhì)控指標。目前研發(fā)生產(chǎn)中主要通過(guò)測定抗體的抗原結合能力來(lái)評價(jià)活性，常用的方法有ELISA法；流式細胞儀法；一些新技術(shù)測定法如SPR技術(shù)，目前應用較為廣泛的是GE醫療生命科學(xué)的Biacore。另外還可以模擬抗體的作用機制，測定其體外生物學(xué)活性并進(jìn)行評價(jià)。
一、抗原結合能力測定
1. ELISA法
? ? ?? 用ELISA法測定抗體的抗原結合能力一般需要具備相應的可溶性抗原。將可溶性抗原包被于96孔板中，待測抗體與標準品作系列稀釋?zhuān)⒎謩e與酶標抗體混合后加入96孔板，待測抗體與標準品將與酶標抗體競爭結合包被抗原，孵育一段時(shí)間后洗脫未結合的抗體，隨著(zhù)待測抗體濃度的降低，酶標抗體與包被抗原的結合量逐漸增加，檢測的吸收值逐漸增高，并與待測抗體的濃度呈負相關(guān)性。對待測抗體濃度、吸光值作四參數擬合，可得到反“S”形曲線(xiàn)，以曲線(xiàn)的IC50 值評價(jià)抗體的抗原結合能力。ELISA方法操作比較簡(jiǎn)單、耐用性好，為避免標記抗體活性或其他試驗因素對測定結果的影響，必須有標準品進(jìn)行平行操作。
2. 流式細胞儀法
? ? ?? 流式細胞儀測定與ELISA法測定原理基本相同，不同的是將可溶性抗原變?yōu)榧毎?，并通過(guò)流式細胞儀測定細胞的陽(yáng)性率指標來(lái)檢測待測抗體與標記抗體的競爭結合情況。該方法的優(yōu)點(diǎn)是選用攜帶抗原的細胞進(jìn)行檢測，細胞表面的抗原空間結構更接近體內存在形式，使待測結果更接近實(shí)際情況，另外該方法還避免了相應抗原的制備純化過(guò)程，對于不易獲得可溶性抗原的抗體可采用該方法進(jìn)行測定（圖1）。
圖1 流式細胞儀測定抗體的抗原結合能力
3. 新技術(shù)測定法
? ? ?? 基于新技術(shù)的生物學(xué)活性測定方法主要有表面等離子共振效價(jià)測定法（SPR）、均相時(shí)間分辨熒光、 Alpha 技術(shù)、熒光染料標記法等，這里我們主要介紹一下SPR法在蛋白活性測定過(guò)程中的應用。
? ? ?? 表面等離子共振技術(shù)（Surface Plasmon Resonance，SPR）是一種用于生物分子間相互作用分析的新技術(shù)，已經(jīng)成為抗體領(lǐng)域分子互作的“金標準”并被FDA收錄。
? ? ?? 目前在基礎科研和制藥行業(yè)被廣泛應用的儀器是GE醫療生命科學(xué)的Biacore。它可以應用于抗體候選物的篩選與評價(jià)；抗體與抗原結合活性的分析；抗體與受體結合活性的分析；抗體活性濃度分析；安全性評價(jià)中的免疫原性分析；生物類(lèi)似藥一致性分析以及抗體生產(chǎn)質(zhì)控與批次放行等。
? ? ?? SPR具體測定過(guò)程如下：將抗體固定于芯片表面，待測抗原通過(guò)微流控系統流經(jīng)其上，抗原抗體一旦結合，芯片表面的物質(zhì)質(zhì)量濃度就會(huì )增加，進(jìn)而引起芯片表面液體折射率的變化而被檢測到。該技術(shù)測定抗原抗體結合活性時(shí)不需要標記，避免了標記對分子結構的影響，能更加真實(shí)地反映抗原抗體的結合情況。它測定周期短，樣品用量少，一般僅有微克級，可用于微量樣品的測定。同時(shí)使用親和力信息及動(dòng)力學(xué)信息來(lái)闡述分子間結合機理（圖2）。
圖2? SPR技術(shù)作用原理
1) 抗體與抗原結合活性的分析，抗體候選物的篩選與評價(jià)
? ? ?? GE醫療生命科學(xué)的Easy Biacore是基于SPR技術(shù)，利用捕獲法檢測抗原抗體之間的相互作用。它主要利用捕獲分子與配體之間高親和的特性，從而實(shí)現對配體定向捕獲（圖3）。該方法操作簡(jiǎn)便，檢測速度快；雜交瘤細胞上清等粗樣品可直接上樣，無(wú)需純化；芯片可再生后反復使用、運行成本低。羅氏診斷對診斷抗體的篩選也是利用了Biacore的“捕獲法”：兔子腹水直接上樣，一次性完成130個(gè)單抗的篩選，并結合Biacore強大的功能做Ranking得到了最好的Top5目的抗體。
圖3 Biacore捕獲法檢測抗原抗體之間相互作用
2) 抗體與受體結合活性的分析，如抗體與FcγRllla、FcγRlllb 等受體結合的親和力、動(dòng)力學(xué)信息
? ? ?? 2019 年 2 月， 首個(gè)國產(chǎn)生物類(lèi)似藥漢利康正式獲批上市, 開(kāi)啟了中國生物類(lèi)似藥新時(shí)代。在生物類(lèi)似藥的分析相似性評價(jià)中，關(guān)鍵一環(huán)就是說(shuō)明藥物的結合活性與原研藥相似度，從而確定me too or me better。復宏漢霖漢利康?（HLX01）的抗體免疫特性的檢測，是基于GE生命科學(xué)的 Biacore 完成的。
? ? ?? 在抗體-FcγR 受體結合活性分析中，使用 Biacore T200 分別檢測了不同抗體與FcγRIa，FcγRIIa，FcγRIIb/c，FcγRIIIa-F，FcγRIIIa-V ，FcγRIIIb 和 FcRn 的結合。Fc 受體結合分析測試的結果顯示，HLX01 與 CN-Rituximab 和 EU-Rituxima 結果高度相似（圖4）。
圖4 HLX01 與 CN-Rituximab 和 EU-Rituxima 相似性結果
3) 抗體活性濃度分析， 包括基于標準品的活性成分濃度分析和無(wú)需依賴(lài)標準品的活性成分濃度分析方法
? ? ?? 目前，GE醫療生命科學(xué)的Biacore基于SPR的無(wú)標曲檢測法（CFCA calibration-free concentration analysis）可用于蛋白樣品的有效活性濃度檢測，這種方法直接檢測有效互作的分子，無(wú)需進(jìn)行復雜的樣品處理和方法建立。結果可靠，簡(jiǎn)單和精準，或可成為活性蛋白濃度檢測基準方法。
? ? ?? Biacore檢測是將配體固定在芯片表面，分析物流經(jīng)芯片表面。在這個(gè)過(guò)程中，分析物的濃度受到物質(zhì)遷移速率的影響。CFCA檢測可通過(guò)分析物以?xún)煞N流速流經(jīng)芯片表面，通過(guò)物質(zhì)遷移速率的計算，儀器自動(dòng)擬合出分析物的濃度（圖5）。
圖5 分析物在流路管路中由溶液向芯片表面垂直擴散
二、生物學(xué)活性測定
1. 補體依賴(lài)細胞毒（complement-dependent cytotoxicity，CDC）作用
? ? ?? 有些抗腫瘤抗體的作用途徑之一是通過(guò)補體依賴(lài)的細胞毒作用。CDC作用機制如下：抗體先與細胞表面抗原結合形成抗原-抗體復合物，抗體Fc 片段的補體結合位點(diǎn)暴露并與補體C1結合,進(jìn)而通過(guò)后續的補體級聯(lián)激活途徑完成攻膜復合物的裝，在細胞表面打孔，最終導致溶細胞效應。
? ? ?? 體外測定抗體CDC 作用的過(guò)程基本是模擬其體內作用方式。選擇具有相應抗原的細胞鋪板，加入不同稀釋度的抗體孵育，使抗體與細胞表面抗原充分結合，然后再加入補體孵育，結合于細胞表面的抗體將補體成分激活，進(jìn)而將細胞殺死。由于抗體濃度不同，細胞的殺傷率也不同，對體濃度及吸光度進(jìn)行四參數曲線(xiàn)擬合可得到反S 形曲線(xiàn)，以其EC 值作為評價(jià)抗體CDC 活性的指標。
2. 殺傷活性中和試驗
? ? ?? 有些細胞因子與其受體結合后能產(chǎn)生細胞殺傷活性，針對該細胞因子的抗體能阻斷其與受體的結合，對其殺傷活性其有中和效應。例如，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）能與胞表面受體結合并對細胞產(chǎn)生毒性作用。因此人們研制出針對TNF-α的抗體用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎的治療。該抗體即可通過(guò)殺傷活性中和試驗來(lái)評價(jià)。選擇一種對殺傷作用敏感的細胞株， 培養至合適密度后加入96 孔板；用一定濃度TNF-α 溶液將待測抗體及標準品作梯度稀釋?zhuān)缓髮⒏飨♂尪鹊目贵w溶液加入含有細胞的孔板中孵育， 抗體與TNF-α結合后斷了其與細胞表面受體的結合· 中和了其細殺傷活性，因此抗體濃度越高，中和作用越強，細胞的生存率也越高；對活細染色后定OD值，對抗體濃度進(jìn)行四參數擬合，以EC50值作為評價(jià)抗體活性的指標。
3. 細胞增殖抑制試驗
? ? ?? 增殖抑制試驗的原理與殺傷抑制試驗相似，同樣是通過(guò)阻斷細胞因子對細胞的作用來(lái)反映抗體的活性。該方法中細胞的生長(cháng)對細胞因子具有依賴(lài)作用，當細胞因子與待測抗體結合后， 無(wú)法與細胞表面受體結合，細胞在得不到增殖刺激的情況下死亡?？贵w濃度越高，增殖抑制作用越強，細胞死亡率越高，繼而擬合得到相應的四參數曲線(xiàn)。
4. 熒光素酶報告基因法測定中和活性
? ? ?? 由于有些細胞因子與細胞表面受體結合后的信號傳導通路已經(jīng)比較了解，可以在細胞中插入熒光素酶報告基因，如果細胞因子與其受體結合，將引起熒光素酶的表達，通過(guò)加入底物顯色可以對結合情況進(jìn)行評價(jià)。針對這些細胞因子的單抗可通過(guò)熒光素酶報告基因法定中和活性，如針對IL-1β 的卡那奴單抗（canakinumab),測定原理如下：將帶有熒光素酶報告基因的鋪板，加入梯度稀釋的待測單抗及參比品，再加入IL-1β，IL-1β能刺激細胞引起熒光素酶的表達，但抗體與IL-1β 結合能中和其作用。隨著(zhù)抗體濃度的增加， 熒光素酶表達量減少， 兩者呈負相關(guān)性， 最后加入底物顯色并檢測，通過(guò)平行線(xiàn)分析法計算待測單抗的活性。
? ? ?? 分子生物學(xué)的快速發(fā)展和細胞信號通路的深入研究促進(jìn)了基于細胞的生物活性測定方法的發(fā)展。越來(lái)越多的新型技術(shù)用于單抗藥物的活性檢測，可以實(shí)現對抗體藥物進(jìn)行精準、多方位、動(dòng)態(tài)的分析，為抗體藥物的質(zhì)量提供了新的保障。
? ? ?? 如涉及知識產(chǎn)權請與我司聯(lián)系
參考文獻：
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