? ? ? ?導語(yǔ)：近年來(lái)，雙特異性抗體（BsAb）的發(fā)展已成為治療凝血功能缺陷和癌癥的一種有前景的策略。T細胞雙特異性抗體(BsAbs)將細胞毒性T淋巴細胞與腫瘤細胞結合，誘導其破壞。盡管目前有60多種雙抗正在開(kāi)發(fā)中，但諸如域間間距或空間構型等參數的相對重要性在很大程度上是未知的。 ? ? ? ?本文中，Santich等剖析了一個(gè)對稱(chēng)的二價(jià)雙抗（IgG-[L]-scFv:anti-CD3單鏈抗體與輕鏈融合的抗腫瘤IgG），以探討價(jià)態(tài)和空間構型對BsAb誘導的T細胞毒性的重要性。他們的結果顯示，在體外和體內，將腫瘤和T細胞結合域放置在BsAb（順式構型）的同一側，與將它們定位在相反側（反式構型）相比，在體外和體內都能產(chǎn)生更強的抗腫瘤活性。此外，在同一個(gè)BsAb中使用兩個(gè)順式結構進(jìn)一步提高了細胞毒性(高達2000倍)。此外，與較小的(G4S1)或較大的(CH1-CH2-CH3)間隔相比，單個(gè)Ig結構域(CL)分離抗原結合成分顯著(zhù)增強細胞因子釋放和體內腫瘤反應。這些發(fā)現為改善BsAb的功能提供了指導，并強調了空間構型和雙二價(jià)作為開(kāi)發(fā)參數的重要性。 ? ? ? ?Santich等以IgG-[L]-scFv架構的BsAb為研究對象，其中之一就是單鏈可變片段（scFv）識別人CD3（huCD3ε）與每個(gè)IgG抗體輕鏈的C末端融合（圖1A）。盡管這種設計在體內和體外對多種腫瘤抗原均具有極強的抗腫瘤活性[GD2(13)、CD33(10)、GPA33(11)和HER2(12)]，其療效的基礎尚不清楚。通過(guò)研究，他們發(fā)現：（1）雙抗價(jià)態(tài)對提高其體外細胞毒性具有重要意義；（2）使用單個(gè)Ig結構域（CL）分離腫瘤和T細胞結合域可以顯著(zhù)改善體外細胞因子分泌和體內抗腫瘤反應；（3）將腫瘤和T細胞結合域放在BsAb（順式結構）的同一側可將細胞毒性作用提高50倍。 圖1. IgG-[L]- scFv與常見(jiàn)BsAb設計的體外比較。2+2為紫色，1+1B為藍色，1+1H為紅色。每條曲線(xiàn)代表一個(gè)BsAb，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)濃度。 一、IgG-[L]-scFv格式比其他常見(jiàn)的BsAb設計更有效 ? ? ? ?Santich等通過(guò)將IgG-[L]-scFv結構與廣泛用于T細胞重定向應用的兩種BsAb結構進(jìn)行比較來(lái)進(jìn)行研究：雙特異性T細胞銜接器（BiTE；與FDA批準的博納吐單抗（Blinatumomab）結構相同）和IgG異二聚體（圖 1A）。使用人源化的3F8（hu3F8）和人源化的OKT3（huOKT3）的可變域序列，分別設計每個(gè)BsAb識別腫瘤細胞上的神經(jīng)節苷脂GD2（GD2）和T細胞上的huCD3ε。BiTE和IgG-[L]-scFv BsAb均使用標準的哺乳動(dòng)物表達和親和純化方法生產(chǎn)，而IgG異二聚體是通過(guò)兩種不同的IgG同二聚體（hu3F8 IgG和huOKT3 IgG）的受控Fab臂交換制得。對于這些親本IgG分子中的每一個(gè)，都引入了兩個(gè)Fc突變之一（帶有K409R的hu3F8或帶有F405L的huOKT3），以促進(jìn)它們在還原條件下的單體化和優(yōu)先異二聚化（圖1B）。 ? ? ? ?通過(guò)流式細胞術(shù)評估與表達抗原的細胞的結合（圖1C），用識別了抗huCD3β（以測量GD2結合）或抗GD2的抗獨特型抗體檢測結合的BsAb（測量CD3結合）的每個(gè)BsAb。在此，就最大有效濃度和半最大有效濃度（EC50）而言，2+2結合的GD2+人類(lèi)M14黑色素瘤細胞比1+1H或1+1B更有效，而所有三種形式均與激活的人類(lèi)T細胞（huATC）類(lèi)似地結合。 ? ? ? ?體外細胞毒性試驗（圖1D）顯示，2+2的效力是1+1H的500倍以上，效力是1+1B的20倍以上。這些結果表明2+2相對于1+1H的細胞毒性?xún)?yōu)勢至少部分歸因于分子的形式。 ? ? ? ?接下來(lái)，他們研究了2+2在體外增強的效力是否會(huì )轉化為更強的體內抗腫瘤活性(圖2)。首先，他們使用了免疫缺陷的異種移植小鼠模型IL-2rg?/?Rag2?/?BALB/c雙敲除(DKO)小鼠(圖2A)。DKO小鼠被皮下植入人類(lèi)黑色素瘤(M14)、靜脈注射huATCs和BsAbs。2+2具有較強的抗腫瘤活性，可縮小大型腫瘤(高達1000mm3)，而1+1H相對于對照組BsAbs (一種針對無(wú)關(guān)腫瘤抗原的IgG-[L]-scfv)沒(méi)有作用(圖2B)。 圖2. IgG- [L] -scFv與常見(jiàn)BsAb設計的體內比較。2+2為紫色，1+1H為紅色，對照BsAb為灰色。 ? ? ? ?2+2和1+1B在體內的藥代動(dòng)力學(xué)特性差異很大，這使得兩者的比較變得復雜；1+1B的血清半衰期為15分鐘(18)，而2+2的半衰期為3天。為了解決這個(gè)問(wèn)題，他們使用了離體的“武裝”T細胞（EAT）異種移植模型，其中huATCs先與BsAbs結合，洗滌后再注射到成神經(jīng)細胞瘤患者衍生的異種移植（PDX）的DKO小鼠中。目的是創(chuàng )造嵌合抗原受體(CAR)樣T細胞，在過(guò)繼轉移前獲得其與腫瘤結合的潛能。它們隨后抗腫瘤功能上的任何差異都可能直接與用來(lái)“武裝”它們的BsAb的細胞毒性效力有關(guān)。在這些實(shí)驗中，對2+2、1+1B和1+1H預孵育方案進(jìn)行了優(yōu)化，使所有EATs都含有相當數量的抗GD2結合結構域。3個(gè)BsAbs在37℃的體外條件下與huATCs穩定結合達3天，表明EATs可以被當作CAR樣T細胞處理。然而，在體內，2+2 EAT具有強大的抗腫瘤活性，而1+1H和1+1B EAT均未顯示任何益處。這些結果證實(shí)了2+2的增強功效，并證明其優(yōu)勢并不僅僅來(lái)自其藥代動(dòng)力學(xué)。綜上，他們的體外數據和三種不同的動(dòng)物模型的結果表明，IgG-[L]-scfv結構比BiTE或IgG異源二聚體結構具有更強的抗腫瘤反應。 二、域間間隔對于IgG- [L] -scFv格式的抗腫瘤活性至關(guān)重要 ? ? ? 接下來(lái)，他們評估了另外兩種雙二價(jià)BsAb結構(圖3A)，一種是IgG-[H]-scfv (2+2HC)和一種基于IgG1的人BiTE-Fc (2+2B)。與使用單個(gè)Ig結構域（CL）分離腫瘤和T細胞結合成分的2+2相反，2+2HC通過(guò)融合每個(gè)抗huCD3 scFv將間隔增加到三個(gè)Ig結構域（CH1-CH2-CH3）每個(gè)抗GD2重鏈的C末端。相反，2+2B在每對scFv之間使用一個(gè)短的(G4S1)連接子來(lái)減少腫瘤和T細胞結合區域之間的距離。在流式細胞術(shù)檢測中，三種BsAb與GD2+人M14黑色素瘤細胞相比較(圖3B)；但是，它們與T細胞的結合卻出乎意料地不同。2+2B最有效地結合，相對于2+2和2+2HC，最大結合和EC50均顯示出增強。2+2HC表現出比2+2大10倍的T細胞結合能力，具有相當的最大結合能力。這些結果表明，結構域間的間距對于T細胞的緊密結合至關(guān)重要，并暗示，與2+2B結構不同，2+2和2+2HC可能不能一致的二價(jià)CD3結合。 圖3.雙二價(jià)BsAb設計的比較。橙色代表抗huCD3（源自huOKT3），藍色代表抗GD2域（源自hu3F8）。2+2為紫色，2+2B為藍色，2+2HC為綠色。 ? ? ? ?出乎意料的是，與2+2相比，2+2B和2+2HC均表現出較2+2降低的體外細胞毒性（圖3C），與2+2相比，2+2的溶解度降低了約2-3倍（分別為80和140fM EC50，而2+2中為38fM）。為了進(jìn)一步研究體外功能的這些差異，他們使用T細胞活化和細胞因子釋放作為下游讀數，對未加工的人類(lèi)T細胞和GD2+M14黑色素瘤細胞進(jìn)行了共培養測定（圖3D）。就總體反應和效力而言，與2+2HC或2+2B相比，2+2誘導的白介素2（IL-2）細胞因子釋放明顯增強。2+2還引起早期反應表面標記CD69和CD25的更強上調，證實(shí)2+2激活的T細胞比2+2B或2+2HC更有效。在沒(méi)有腫瘤細胞的情況下，BsAbs均未誘導可測量的細胞因子釋放或T細胞激活，表明這些反應完全依賴(lài)于抗原。 圖4. 雙二價(jià)BsAb設計的體內比較。2+2為紫色，2+2B為藍色，2+2HC為綠色，對照組(無(wú)BsAb)為灰色。 ? ? ? ?為了確定結構域間距對體內腫瘤反應的影響，他們使用兩種常規方法比較這三種結構(圖4)。在這兩種方法中，只有2+2激發(fā)了強大的抗腫瘤反應，而2+2B和2+2HC顯示出的效果與對照組相差不大。這些結果是出乎意料的，他們提出兩個(gè)觀(guān)點(diǎn)：①光憑二價(jià)不足以產(chǎn)生強大的抗腫瘤效力；②結構域間距的減小不一定會(huì )增加細胞毒性。相反，2+2設計的優(yōu)越性表明，最優(yōu)的結構域間距和空間構型對于體內外抗腫瘤反應的產(chǎn)生至關(guān)重要。 三、價(jià)態(tài)可提高IgG-[L]-scFv結構的腫瘤和T細胞結合 ? ? ? ?為了確定具有顯著(zhù)抗腫瘤活性的IgG-[L]-scFv結構的特性，Santich等設計了四種新的IgG-[L]-scFv異源二聚體(圖5)，它們代表了所有可能的價(jià)和結構域間空間構型的組合。 圖5. 系列IgG- [L] -scFv的體外結合活性。圖A、B中，橘色域代表anti-huCD3、藍色領(lǐng)域代表anti-GD2、黑色條紋域代表無(wú)關(guān)anti-CD33。圖D：共軛分析原理圖(左)和結果圖表(右)。未共軛細胞(左上和右下象限)在一個(gè)通道下顯示熒光，而共軛細胞(右上象限)在兩個(gè)通道下顯示熒光。分析時(shí)，以偶聯(lián)T細胞在總T細胞中的比例(紅色方框)來(lái)測量偶聯(lián)頻率。2+2為紫色，1+1H為紅色，2+1為藍色，1+1T為綠色，1+1C為棕色，1+2為橙色，對照BsAb為灰色。 ? ? ? ?SPR（surface plasmon resonance，表面等離子體共振）及流式細胞術(shù)測定結果均顯示，二價(jià)BsAb比單價(jià)BsAb更能與細胞相關(guān)抗原結合（圖5C）。為了評估當兩種抗原同時(shí)結合時(shí)，與GD2和huCD3結合的差異是如何產(chǎn)生的，他們進(jìn)行了體外細胞-細胞結合試驗（圖5D）。流式結果顯示，2+2在本實(shí)驗中最有效，其次是2+1，其余結構（1+2、1+1T、1+1C和1+1H）的活性明顯降低。 ? ? ? ?這些結果表明，二價(jià)體，特別是對腫瘤的作用，改善了結合物的形成，是細胞毒性的重要一步。1+1C和1+1T結合抗原或誘導結合物的能力差異不明顯，說(shuō)明腫瘤和T細胞結合域的空間構型不影響結合物的形成。 四、空間構型決定IgG-[L]-scFv的體內外功能 ? ? ? ?M14黑色素瘤細胞的體外細胞毒性試驗顯示，系列IgG-[L]-scFv存在顯著(zhù)差異（圖6A）。2+2誘導的抗腫瘤細胞毒性最強（26fM，EC50），其次是2+1（240fM，EC50）和1+2（773fM，EC50），分別是9倍和30倍。 圖6. 系列IgG-[L]- scFv體外功能活性研究。2+2為紫色，1+1H為紅色，2+1為藍色，1+1T為綠色，1+1C為棕色，1+2為橙色，控制組BsAb為灰色。 ? ? ? ?為了探索價(jià)數和空間構型的差異如何影響原始T細胞活化，他們使用體外共培養測定法比較了系列IgG-[L]-scFv（圖6，B至F）。IL-2的分泌再次揭示了不同BsAb變體之間的主要差異。2+2引起的IL-2分泌明顯比所有其他BsAb更強，顯示出比下一個(gè)最具刺激性的變體高近100倍的效力（圖6B）。2+1、1+2和1+1C表現出中等效力，1+1T和1+1H在檢測下限附近誘導弱的IL-2分泌。T細胞的活化和增殖通常遵循相同的等級順序，盡管差異較小，并且對于CD4+和CD8+T細胞子集均保持一致（圖6，C-F）。2+2顯示出最高的效價(jià)，而1+1T始終是最弱的，與1+1H沒(méi)有區別，刺激性比2+2低約200倍。2+1、1+2和1+1C通常以中等強度聚集在一起，其中2+1顯示出更有效的激活，然后依次是1+2和1+1C。如前所述，與BsAb一起孵育但沒(méi)有腫瘤細胞的T細胞沒(méi)有表現出任何可測量的反應，表明BsAb介導的T細胞活化是抗原依賴(lài)性的。 ? ? ? ?1+1C和1+1T之間的顯著(zhù)性差異表明，抗原結合結構域的空間構型是體外BsAb活性的關(guān)鍵決定因素。此外，盡管2+2在2+1和1+2上顯示出更高的效力，但2+1和1+2都不優(yōu)于1+1C。因此，當抗原結合域的增加創(chuàng )造了一個(gè)額外的順式結構時(shí)，它最有效地改善了效力?？傊?，這些數據表明，IgG-[L]-scFv框架內的雙重二價(jià)通過(guò)改善細胞結合并以順式結構呈遞腫瘤和T細胞結合來(lái)增強BsAb功能。 ? ? ? ?在帶有皮下人黑素瘤（M14）腫瘤并用BsAb和huATC治療的DKO小鼠中（圖7A），2+2再次顯示出最強的抗腫瘤活性（圖7B）。2+1最初對2+2引起相似的反應，但最終的持久性較差，治療結束后腫瘤迅速復發(fā)。與體外功能研究一致，1+2和1+1C均顯示中等的抗腫瘤活性，但明顯比2+1和2+2差。最后，相對于用對照BsAb治療的小鼠，1+1H和1+1T均未顯示任何抗腫瘤功效。 圖7. 系列IgG-[L]-scFv的體內抗腫瘤活性。2+2為紫色，1+1H為紅色，2+1為藍色，1+1T為綠色，1+1C為棕色，1+2為橙色，控制組BsAb為灰色。 ? ? ? ?總體而言，這些結果與他們的體外研究結果一致，并證實(shí)了順式結構的腫瘤和T細胞結合域的重要性。 ? ? ? ?原創(chuàng )內容未經(jīng)授權，禁止轉載至其他平臺。
內容來(lái)源： Santich B H, Park J A, Tran H, et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies[J]. Science Translational Medicine, 2020, 12(534). |
